ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ ПО ЦИЛЮ НИЛЬСЕНУ

При простых способах окраски применяют какой-нибудь один краситель: метиленовый синий или водно-спиртовой раствор фуксина.

Простыми способами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материале микробов, определяя их коли­чество, форму и расположение.

Препараты, содержащие, кроме бактерий, тканевые и кле­точные элементы, красят метиленовым синим. При этом фон препарата окрашивается значительно слабее, чем тела микроб­ных клеток.

6.3.1. Техника окраски мазков

Окраска мазков красящими бумажками по А.И. Синеву. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А.И. Синевым. Простота приготовле­ния, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при раз­личных способах окраски. Рецепты приготовления красок и реактивов, применяемых при окраске бактериальных препара­тов, даны в Приложении (рецепт 26).

Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные кусочки бумаги величиной 2×2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влаж­ной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется видом окрашиваемого мик­роба. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пин­цетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсуши­вают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. Для ориентировоч­ной окраски высушенного и фиксированного над огнем мазка используют один из следующих красителей:

• на мазок наливают спиртово-водный раствор метиленового синего (рецепт 8) на 3–5 мин;
• водный раствор метиленового синего (рецепт 11) наливают на мазок на 5–10 мин;
• метиленовый синий Леффлера (рецепт 9) окрашивает 1– 2 мин;
• разведенный 1:10 карболовый фуксин (рецепт 18) наливают на фильтровальную бумагу, положенную на фиксированный высушенный мазок для задержки частиц красителя. Окра­шивание препарата проводят не более 10–30 с.

Окрашенные препараты промывают водопроводной водой до тех пор, пока в воде не останется следов краски, затем препарат высушивают на воздухе и микроскопируют.

Источник

Краски и растворы применяемые при окрашивании мазков

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Простые методы окраски

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Сложные методы окраски

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных — он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% — 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% — 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах , концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

Источник



ОКРАСКА МАЗКОВ

Лейкоцитарная формула – это процентное соотношение различных видов лейкоцитов. Подсчитывается при микроскопии окрашенных мазков крови или в гематологических анализаторах.

Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.

Подготовка стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) замачивают на 8-10 часов в 2% растворе хозяйственного мыла или СМС в эмалированной посуде, кипятят в этом же растворе 5-10 минут. Более длительное кипячение и использование алюминиевой посуды не рекомендуется, так как приводит к помутнению стекол. Промывают стекла в проточной воде, насухо вытирают и помещают для обезжиривания на 30-60 минут в смесь Никифорова (спирт 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1). Насухо вытирают чистой тканью и хранят в закрытой чистой посуде.

Приготовление мазков. Мазок крови делается с помощью шлифованного стекла с идеально ровным краем, ширина которого должна быть на 2-3мм меньше, чем у предметного стекла. После прокола пальца первую каплю удаляют сухим ватным тампоном. К куполу следующей капли прикасаются предметным стеклом на расстоянии 1,5-2см от края стекла. К коже в месте прокола не прикасаться! Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2-3мм. Шлифованное стекло ставят под углом 45º на 1-2мм перед каплей и двигают его назад к капле так, чтобы вся кровь растеклась по краю шлифованного стекла. Быстрым легким движением делают мазок, пока не кончится вся капля крови. Высушивают мазки на воздухе. Маркируют их простым карандашом, обозначая на толстой части мазка фамилию и инициалы пациента или его регистрационный номер. Делают не менее двух мазков.

Требования к мазку. Правильно приготовленный мазок должен быть:

— равномерной толщины, полупрозрачным, желтоватого цвета;

— достаточной величины – занимать ½ — ¾ длины предметного стекла, отступив от края на 1-1,5см;

Толстые мазки для исследования не пригодны, так как клетки в них располагаются в несколько слоев и деформируются. В правильно приготовленных тонких мазках клетки располагаются в один слой.

Готовые высушенные мазки крови фиксируют, а затем окрашивают. В неокрашенном виде мазки сохраняются при комнатной температуре в течение 3 дней.

Фиксация мазков предохраняет элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных мазках происходит разрушение эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксация также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Фиксацию проводят либо в специальной кювете, либо в широкогорлой банке с хорошо закрывающейся крышкой.

Для фиксации используют следующие реактивы:

— метиловый спирт – время фиксации 3-5 минут;

— раствор эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду (фиксация 3 минуты);

— этиловый спирт (фиксация 20-25 минут);

— смесь Никифорова (фиксация 30 минут).

Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окрашивают.

Окраска мазков. Проводится в специальных кюветах или на «мостике». В качестве унифицированных приняты 3 метода окраски мазков крови:

Принцип окраски мазков крови.Основу современных методов окраски клеток крови заложил русский врач Д.Л. Романовский, который в конце 19 века предложил окрашивать препараты одновременно двумя красителями – щелочной и кислой реакции. Различные клеточные структуры имеют разную рН и связываются с красителем противоположной реакции. Ядра клеток богаты нуклеиновыми кислотами, имеют кислую реакцию и окрашиваются красителями щелочной реакции (метиленовым синим, азуром I и II) в сине-фиолетовый цвет. Цитоплазма гранулоцитов, зернистость эозинофилов, эритроциты содержат щелочные белки, поэтому окрашиваются красителем кислой реакции (эозином) в розовый цвет.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Реактив: готовая краска Романовского. В её состав входит азур-II (смесь равных частей азура-I и метиленового синего) и эозин. Заводская краска очень концентрированная и перед употреблением её нужно разводить. Степень разведения и время окраски определяется опытным путем и называется титрование краски Романовского.

Титрование краски Романовского. Готовят три разведения краски из расчета: 1, 2 и 3 капли красителя на 1мл дистиллированной воды. Каждым из разведений окрашивают 5 зафиксированных мазков в течение 20, 25, 30, 35 и 40 минут. На каждом мазке отмечают время окраски и разведение красителя. После окрашивания микроскопируют мазки и определяют разведение и время, при которых получена наилучшая окраска. Эти условия, соответствующие лучшему окрашиванию, указывают на этикетке бутыли с краской. Например: титр краски – 1капля/мл; экспозиция – 30 минут. Титрование краски Романовского проводят один раз перед использованием каждой новой партии красителя.

Ход окраски.В специальную кювету для окрашивания наливают раствор краски Романовского, приготовленный непосредственно перед использованием в соответствии с установленным титром. В рабочий раствор красителя опускают штатив с сухими фиксированными мазками. Красят мазки в соответствии с выбранной экспозицией. Промывают мазки проточной водой и высушивают на воздухе.

Источник

Окраска микроорганизмов

Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим

В лаборатории применяются анилиновые краски, приготавливаемые из анилина и других производных каменноугольного дегтя. Для окраски препаратов применяются основные и кислые краски. Основные краски хорошо воспринимаются микробами и ядерным хроматином. Кислые краски хорошо окрашивают протоплазму и слабее микроорганизмы.

Кислыми красителями называются свободные окрашенные кислоты или соли этих кислот, обычно соли натрия. Основные красители — это соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты.

Насыщенные спиртовые растворы красок, из которых готовят рабочие краски, хранят в стеклянных банках с притертой пробкой.

Изготовление растворов заключается в следующем.

В флакон с притертой пробкой насыпают 10 г сухой краски, наливают 100 мл 96° спирта ректификата и при ежедневном взбалтывании оставляют раствор на несколько дней, после чего эта краска может быть употреблена для спирто-водных растворов, необходимых для окраски препаратов.

Наиболее часто употребляющиеся растворы красок:

Разведенный фуксин (фуксин Пфейффера)

10 мл карболового фуксина Циля, 90 мл дистиллированной воды. Этот раствор при хранении портится, поэтому его готовят по мере надобности и хранят не более суток.

Карболовый раствор кристалл-виолета

Краски — 1 г Спирта ректификата 96°— 10 мл Кристаллической карболовой кислоты — 2 г Дистиллированной воды — 100 мл

Краску растирают с карболовой кислотой, добавляя спирт, а потом дистиллированную воду, через сутки фильтруют.

Примечание. Вместо кристалл-виолета можно пользоваться насыщенными растворами метил-виолета либо генцианвиолета. Последний при окрашивании выпадет в осадок, в практике он менее применим.

Окраска по методу Синева

Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные спиртовым раствором краски. Листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, обливают 1—2% раствором (в 96° спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2X4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Приготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время. Приготовленные препараты красятся в зависимости от исследуемого материала простым либо сложным методом.

К простому методу относится: окраска разведенным фуксином (фуксином Пфейффера), окраска щелочной метиленовой синькой. Окраска разведенным фуксином. На приготовленный на предметном стекле фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают на 1—2 минуты разведенный фуксин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание метиленовой синькой. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой метиленовую синьку на 2—3 минуты, после чего препарат смывают водой и высушивают.

Ядра при этом окрашивании более интенсивно воспринимают окраску и резко выделяются над протоплазмой, которая окрашивается слабее.

К сложным методам окраски относятся окрашивания одного и того же препарата растворами нескольких красок в определенном порядке для дифференциации микробов вследствие их сродства к определенным краскам.

В число сложных методов входят: окраска кислотоустойчивых микробов по Циль-Нильсену, окраска по Граму, окраска па Романовскому-Гимза и другие.

— Читать далее «Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму»

Оглавление темы «Микроскопия и подготовка препаратов к микроскопии»: 1.

Микроскопическое исследование. Подготовка материала для микроскопического исследования2. Темнопольная микроскопия. Техника темнопольной микроскопии3. Фазово-контрастная микроскопия. Техника фазово-контрастной микроскопии4. Подготовка материала для электронной микроскопии.

Подготовка материала к окраске5. Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим6. Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму7. Окраска по Романовскому-Гимза. Окраска спор8. Приготовление питательных сред. Требования к питательным средам9. Взятие малых количеств крови. Как брать кровь из пальца для исследований?10. Приготовление мазков крови.

Взятие крови для определения СОЭ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 … 40

ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ.

Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в кле­точной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной кра­ситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечи­ваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем. .

Mycobacterium tuberculosis в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Увеличение х___________________

ОКРАСКА СПОР ПО ОЖЕШКО.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.

Окраска по Ожешко. Увеличение х_

ОКРАСКА ВОЛЮТИНА ПО НЕИССЕРУ.

При окраске метиленовым синим образуется нерастворимый в воде комплекс: кра­ситель + волютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы волютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем докрашивается везувином в желтый цвет.

Corynebacterium diphtheriae. Окраска по Нейссеру. Увеличение х_

БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ

Бактериоскопический метод диагностики -______________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________

Метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическими, тинкториальными свойствами и типичной ло­кализацией в организме. Например: гонорея, сифилис, возвратные тифы, туберку­лез, некоторые микозы.

Грам (+) и Грам (-) представители и их воздействие на организм

Итак, клеточная стенка грамположительных бактерий имеет лишь один слой. Единственное исключение, известное в современной микробиологии, – Deinococcus-Thermus. Несмотря на наличие защитной мембраны, при проведении теста она хорошо окрашивается в синий цвет.

Основными представителями Грам (+) бактерий являются:

1. Кокковые или шаровидные (кроме протеобактерий Neisseria):
   • стафилококк, провоцирующий сепсис крови и гнойные высыпания на коже;
   • стрептококк, ведущий к развитию ревматизма и тонзиллитов;

• фирмикуты, служащие источником сибирской язвы и токсических инфекций;
• клостридии, как возбудители столбняка и ботулизма;
• листерия, заражение которой приводит к воспалению мозга.

Грамотрицательные бактерии, более устойчивые к антителам за счет дополнительной мембраны, представлены такими разновидностями:

1. Спиралевидные:
   • спирохеты, которые являются возбудителями лептоспироза, возвратного тифа и сифилиса;
   • спириллы, вызывающие содоку – лихорадкоподобное состояние.
2. Палочки:
   • риккетсии, чей главной характеристикой служит внутриклеточный паразитизм;
   • хламидии – без лечения могут развиться ЗППП, конъюнктивит, пневмония.

Алгоритм окраски по Ожешко;

Алгоритм окраски по Бурри-Гинсу

Морфологические значения клетки

1. На предметное стекло (ближе к узкому краю) нанести каплю черной туши, разведенной в 10 раз.

2. В нее внести каплю культуры, перемешать две капли

3. Ребром шлифовального стекла сделать мазок, так же как и мазок крови

4. Высушить на воздухе

5. Зафиксировать химическим способом

Осторожно промыть водой. 7

Окрасить фуксином Пфейффера — 3-5 минут

7. Окрасить фуксином Пфейффера — 3-5 минут

Осторожно промыть водой, высушить на воздухе

Фильтровальной бумагой для высушивания препарата не пользоваться, не повредить препарат.

Микроскопия иммерсионная. Видим: фон препарата черный, клетки красные, капсулы не окрашены, в виде бесцветного ореола вокруг клетки.

1. На высушенный на воздухе мазок налить несколько капель 0,5% р-ра хлороводородной кислоты.

2. Подогреть до образования паров

3. Высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки

4. Фиксировать препарат покрыть фильтровальной бумагой и нанести фуксин Циля

5. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогреть над пламенем спиртовки до отхождения паров. Добавляя красителя подогреть 2-3 раза

6. После охлаждения препарата снять бумажку и промыть водой.

7. Препарат обесцветить 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор

8. Промыть водой

9. Окрасить водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-4 минут

10. Промыть водой, высушить

11. Микроскопия иммерсионная. Споры — красные, клетки — синие.

Окраска спор по методу Ожешко

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2—3 мин на пламени.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

3. Окрасить по методу Циля—Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера—Фултона

1. На фиксированный мазок нанести 5 % раствор мала­хитового зеленого и 3—4 раза нагреть до появления паров.

2. Промыть водой.

3. Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ ные клетки — в красный.

185.238.139.36 studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock! и обновите страницу (F5)очень нужно

Метод Бурри

Техника. Каплю исследуемой культуры смешивают на пред­метном стекле с каплей туши, затем с помощью другого стекла, поставленного к первому под углом в 45, делают тон­кий мазок по принципу приготовления мазков из крови.

Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют нефиксированным.

При использовании раствора конго рот после высушива­ния мазок обрабатывают 1% раствором соляной кислоты в аб­солютном алкоголе, затем высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: на окрашенном фоне ясно видны неокрашенные светлые микробные клетки.

ОКРАСКА ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В микробиологической работе наиболее употребительны способы окраски фиксированных микроскопических препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные, или простые, и дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности того или иного вида микроорганизма.

Простые методы окраски микробов

Простые методы окраски препаратов предполагают использование одного анилинового красителя и позволяют изучить такие морфологические признаки микроорганизма, как форму, размеры, расположение в мазке. Для этих целей используется ряд красителей: метилено­вый синий, фуксин и др.

Окраска разведенным карболовым фук­сином

Техника. На зафиксированный мазок наносят фуксин Циля, разведенный непосредственно перед окраской, дистилли­рованной водой в соотношении 1:10. Выдерживают 1-2 минуты, после чего смывают водопроводной водой, высушивают и микро­скопируют.

Микроскопическая картина. Все клетки равномерно окра­шиваются в розово-красный цвет.Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Препараты для люминесцентной микроскопии готовят так же, как для световой.

Это относится и к их фик­сации. Окраска препаратов отличается тем, что для люми­несцентной микроскопии применяют специальные красители – флуорохромы. Их отличительная особенность – способность све­титься под воздействием ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Среди флуорохромов встречаются самые разнообразные органические вещества. Для окраски микроскопических препаратов применяют очень слабо концентрированные (1:500-1:100000) растворы флуорохромов.

Растворы готовят на дистиллированной воде, изотоническом растворе хлорида натрия или буферных смесях и хранят в тем­ной склянке, избегая действия света.

Нарисуем невидимое, или Методы окраски микроорганизмов

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Работа с фиксированными препаратами

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Источник